禾草種帶內生真菌鏡檢前種子一體化處理裝置

技術(shù)領(lǐng)域

本實(shí)用新型涉及一種大批量禾草種帶內生真菌鏡檢前種子一體化處理裝置，它集裝樣，軟化，洗滌，染色和加熱一體化，大大縮減了鏡檢前種子處理時(shí)間、統一了樣品量、強化了染色效果和試劑的循環(huán)利用。

背景技術(shù)

禾草內生真菌(grass endophyte)是指在禾草體內度過(guò)大部分或者全部生命周期，但卻不會(huì )引起禾草外部顯示任何病害癥狀的一大類(lèi)真菌。從最初發(fā)現黑麥草(Loliumperenne)和高羊茅(Festuca arundinacea)引起家畜中毒到后來(lái)其攜帶的內生真菌被發(fā)現，以及進(jìn)一步的研究證實(shí)，內生真菌的存在不但導致家畜中毒而且能顯著(zhù)提高宿主在群落中的競爭力，也因禾草內生真菌的這種重要生理和生態(tài)作用，使其逐步成為國內外研究的熱點(diǎn)之一，這也給內生真菌檢測技術(shù)的發(fā)展提供了契機。目前禾草內生真菌的檢測方法有鏡檢和分離檢測、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked Immunosorbent AssayELISA)、全基因組測序、實(shí)時(shí)熒光PCR法(Realtime PCR)和利用次生代謝物間接檢測。

1.鏡檢：(1.)用NaOH種皮軟化；(2.)用自來(lái)水洗滌；(3.)染色；(4.)鏡檢。

2.分離檢測：用酒精浸泡10min，NaClO浸泡8min，再用無(wú)菌水反復沖洗數次，用濾紙吸干后，放置PAD培養，內生真菌在PDA培養基生長(cháng)一般需要一個(gè)禮拜。

3.酶聯(lián)免疫吸附測定法：(1.)待檢標本提取(2.)用已知特異性抗體包被固相載體；(3.)加待檢標本，經(jīng)過(guò)溫育使相應抗原與固相抗體結合；洗滌，除去無(wú)關(guān)的物質(zhì)；(4.)加酶標特異性抗體，與已結合在固相抗體上的抗原反應；洗滌，除去未結合的酶標抗體；(5.)加底物顯色。終止反應后，目測定性或用酶標儀測量光密度值進(jìn)行定量測定。

4.全基因組測序:提取菌絲DNA，再進(jìn)行測序。

5.實(shí)時(shí)PCR，該技術(shù)是在常規PCR的基礎上加入了熒光特殊物質(zhì)來(lái)標記產(chǎn)物，分析產(chǎn)物，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)計算其初始濃度。

6.利用次生代謝物間接檢測：生物堿的提取，目前對于生物堿的檢測主要是運用不同的色譜檢測方法：高效液相色譜法(HPLC)，質(zhì)譜法(MS)和氣相色譜法(GC)。HPLC檢測生物堿時(shí)需要選擇適合該生物堿分離的流動(dòng)相和檢測器，不同種類(lèi)的生物堿，其選擇的流動(dòng)相pH值和濃度不同。

從上述可以看出，鏡檢跟分離檢測相比所需時(shí)間要短，可以大批量檢測；與酶聯(lián)免疫吸附測定法相比簡(jiǎn)單易操作、耗時(shí)短、經(jīng)濟實(shí)惠；與全基因組測序和實(shí)時(shí)PCR相比經(jīng)濟實(shí)惠，適合大批量檢測；與利用次生代謝物間接檢測耗時(shí)短、經(jīng)濟實(shí)惠、簡(jiǎn)單易操作。但這種簡(jiǎn)單易操作、耗時(shí)短、經(jīng)濟實(shí)惠的方法在裝樣，軟化，洗滌，染色和加熱方面卻沒(méi)有與之相關(guān)的裝置，平時(shí)人們用離心管代替。而用離心管存在很多問(wèn)題：(1.)裝樣時(shí)，沒(méi)有參考標準，因人而異，造成種子的浪費和軟化，染色的不徹底。(2.)用NaOH對禾草種子進(jìn)行軟化處理后，需要將軟化液吸取干凈，由于針管頭細小，在吸取過(guò)程容易造成針管堵塞，需要多次反復吸取，耗費大量的時(shí)間。(3.)由于禾草種子小，在洗滌時(shí)會(huì )使部分種子外流，造成浪費，同時(shí)需要反復清洗，盡量把NaOH溶液清洗干凈，否則會(huì )對染色造成影響，這個(gè)過(guò)程對大批量的禾草種子來(lái)說(shuō)顯得異常繁瑣和浪費時(shí)間。(4.)染色時(shí)需要加熱，需要把離心管移到水浴鍋中加熱，在過(guò)程中可能混淆和洗掉原先的標記，造成實(shí)驗的失敗，同時(shí)要把染色完的試劑倒掉，造成試劑的浪費，對環(huán)境造成一定的污染。

實(shí)用新型內容

為了解決上述裝置中存在的問(wèn)題，本實(shí)用新型提供了一種集裝樣，軟化，洗滌，染色和加熱的禾草種帶內生真菌鏡檢前種子一體化處理裝置，大大縮減了鏡檢前種子處理時(shí)間、簡(jiǎn)化了其軟化液和洗滌液的吸取過(guò)程。

技術(shù)負責人： 陳振江 ; 李春杰   草地農業(yè)科技學(xué)院