利用PCR-SSCP快速檢測綿羊NELF基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應用 ...

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及綿羊單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標記的篩選與檢測，特別涉及利用PCR-SSCP方法快速檢測NELF基因組第454位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。具體來(lái)說(shuō)，就是對PCR擴增獲得的產(chǎn)物變性之后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后根據電泳結果確定其單核苷酸多態(tài)性。

背景技術(shù)

近20年來(lái)，尤其是近10年來(lái)，分子遺傳學(xué)和分子生物技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，其中，分子遺傳標記是目前在家畜育種中研究得最多的內容，也是近期內最可能在家畜育種中得到廣泛應用的研究項目。遺傳標記是指那些可以準確鑒別的、能反映個(gè)體特異性的遺傳特征。分子遺傳標記則是指以個(gè)體遺傳物質(zhì)即核苷酸序列變異為基礎的DNA分子標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。利用分子標記輔助選擇育種，是現代動(dòng)物分子育種的一項主要研究?jì)热?，其直接?/font>DNA水平上對性狀的基因型進(jìn)行選擇，因此其選種的準確性大大提高，克服了傳統動(dòng)物育種方法的缺陷。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是一種重要的分子遺傳標記，它是由美國學(xué)者Lander于1996年提出的第三代DNA遺傳標記，是基因組中單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基的轉換、插入及缺失等形式。PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構象，其構象直接影響泳動(dòng)速率，相同長(cháng)度的DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構象的不同，造成泳動(dòng)速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶。因此，可以通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)檢測基因組是否存在SNP位點(diǎn)，并且準確的鑒別SNP位點(diǎn)的基因型?，F在已經(jīng)公認單鏈構象多態(tài)性(SSCP)可作為遺傳標記應用于育種中。該方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且檢測序列位點(diǎn)無(wú)特殊要求。

鼻胚胎促黃體激素釋放激素因子(Nasal embryonic LHRH factor，NELF)編碼基因與動(dòng)物的生殖有密切關(guān)系。Samuel D.Quaynor等通過(guò)創(chuàng )建純合NELF敲除(KO)小鼠模型，證明雌性小鼠NELF基因敲除將推遲陰道口開(kāi)放，并沒(méi)有延遲第一次發(fā)情的時(shí)間，減少了子宮重量并且減少了GnRH的神經(jīng)元數目。與此相反，雄性小鼠的青春期表現正常。NELF敲除導致雌雄小鼠都表現為生育能力受損，平均窩產(chǎn)仔數降低。此外，越來(lái)越多的報道表明，NELF在小鼠的生殖方面有重要作用。綿羊的NELF基因定位在第20號染色體上，全長(cháng)5928bp，編碼區全長(cháng)1112bp。

目前，國內外對NELF基因多態(tài)性的研究主要集中于小鼠等模式動(dòng)物，而對于家畜NELF基因單核苷酸多態(tài)性的研究尚未見(jiàn)報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用PCR-SSCP快速檢測綿羊NELF基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應用，從而為綿羊的分子標記輔助選擇育種提供基礎資料，加快中國綿羊的種質(zhì)資源改良工作。

技術(shù)負責人： 樂(lè )祥鵬 草地農業(yè)科技學(xué)院