一種檢測綿羊KITLG基因的單核苷酸多態(tài)性的方法及其應用

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以綿羊的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標記，特別涉及綿羊KITLG基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。

背景技術(shù)

在動(dòng)物育種中，人們期望通過(guò)對生長(cháng)、繁殖等性狀密切相關(guān)，并且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。

分子育種，即分子標記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)，該技術(shù)是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，它是利用現代分子生物學(xué)和傳統遺傳育種相結合的方法，進(jìn)行新品種選育。

基因多態(tài)性是指不同物種或者同一物種內的不同個(gè)體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是由美國麻省理工學(xué)院的人類(lèi)基因組研究中心的學(xué)者Lander(1996)提出的一類(lèi)遺傳標記系統，就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數量非常豐富的變異形式，占人類(lèi)基因組中遺傳多態(tài)性的90％以上。SNP與罕見(jiàn)的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1％的此種變異被稱(chēng)為突變，而只有頻率大于1％時(shí)才被稱(chēng)為單核苷酸多態(tài)性。它的變異形式有：顛換、轉換、插入和缺失等，主要由單個(gè)堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型的堿基變異的SNPs約占2/3。

根據基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類(lèi)：基因編碼區單核苷酸多態(tài)性(Coding-region SNPs,cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(Intergenic SNPs,iSNPs)。

研究表明，位于編碼區內的cSNP比較少?；蚓幋a區內的cSNP又可分為2種：一種是編碼區內的同義cSNP(Synonymous cSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會(huì )影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區內的非同義cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而導致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。

由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs很罕見(jiàn)，故SNPs通常被簡(jiǎn)單地稱(chēng)為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線(xiàn)來(lái)發(fā)現SNPs：即DNA序列測定方法、聚合酶鏈反應—單鏈構象多態(tài)(Polymerase Chain Reaction-SingleStrand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)與DNA測序結合法、等位特異性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時(shí)，在測序過(guò)程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗過(guò)程比較長(cháng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗過(guò)程中存在假陽(yáng)性問(wèn)題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來(lái)的應用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測過(guò)程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術(shù)檢測SNP位點(diǎn)，需要平板讀數儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實(shí)驗室來(lái)說(shuō)可實(shí)施性不強。

限制性片段長(cháng)度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(Restriction Fragment LengthPolymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR)方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現SNP位點(diǎn)后設計上下游引物用限制性?xún)惹忻高M(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且所檢測的序列位點(diǎn)無(wú)特殊性要求。

KITLG(KIT Ligand，KL或KitL)是一種分泌生長(cháng)因子，又被稱(chēng)為干細胞因子(StemCell Factor，SCF)，肥大細胞因子(Mast Stem Cell Factor，MCGF)或Steel因子(SteelFactor，SLF)，屬于酪氨酸激酶受體家族。KITLG由Mgf cDNA編碼，由284個(gè)氨基酸組成。KITLG mRNA主要在卵泡的顆粒細胞中表達)。KITLG通過(guò)其受體KIT信號影響卵母細胞與顆粒細胞之間的相互作用。顆粒細胞中的KITLG和卵母細胞中的KIT之間的互作對動(dòng)物繁殖是不可或缺的。KITLG在原始生殖細胞(Primordial Germ Cells，PGCs)的生存、增殖、遷移以及卵泡的發(fā)育中發(fā)揮作用。KITLG在卵泡發(fā)育中也起很重要的作用。KITLG結合KIT誘發(fā)PI3K通路在其它多種信號通路協(xié)調下傳導信息，激活卵母細胞，促進(jìn)卵母細胞的生長(cháng)和分泌作用。雖然有關(guān)KITLG基因在動(dòng)物繁殖方面的作用的研究取得了一些進(jìn)展，但是在綿羊上的研究報道較少。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測綿羊KITLG基因的單核苷酸多態(tài)性的方法及其應用，利用PCR-RFLP方法針對其基因位點(diǎn)上的突變進(jìn)行檢測，提前淘汰劣勢個(gè)體，加快高繁種羊群體的建立。

技術(shù)負責人： 樂(lè )祥鵬  草地農業(yè)科技學(xué)院