一種α促黑素細胞激素的融合蛋白及其制備方法和應用

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一種α促黑素細胞激素的融合蛋白及其制備方法和應用。

背景技術(shù)

血管損傷，炎癥以及外傷引起的腦組織損傷會(huì )導致機體的認知功能障礙，這類(lèi)疾病嚴重影響著(zhù)人們的生活質(zhì)量和工作效率。目前針對上述疾病的臨床藥物大多關(guān)注腦神經(jīng)組織的修復和保護，事實(shí)上，除了神經(jīng)細胞以外，星型膠質(zhì)細胞、寡樹(shù)突膠質(zhì)細胞、內皮細胞以及小膠質(zhì)細胞同樣需要損傷后的修復。內源性免疫神經(jīng)調節肽α促黑素細胞激素(α-Melanocytestimulating hormone，α-MSH)具有潛在的抗炎，神經(jīng)營(yíng)養，抗凋亡效應。對上述疾病具有顯著(zhù)的治療潛力，而且相對于傳統的抗代謝免疫抑制劑副作用較小，在基礎研究與臨床治療中都具有重要價(jià)值，有望成為新型的神經(jīng)保護劑，是一種前景廣闊的臨床候選藥物。

α-MSH的免疫調節效應經(jīng)下述途徑產(chǎn)生：(1)直接作用于外周巨噬、單核和嗜中性粒細胞等免疫細胞上的α-MSH受體；(2)作用于腦內神經(jīng)元上的α-MSH受體，進(jìn)而啟動(dòng)下游抗炎神經(jīng)通路；(3)中樞神經(jīng)系統的局部炎癥由局部產(chǎn)生的α-MSH通過(guò)作用于中樞小膠質(zhì)細胞和星形細胞而被抑制，也可由外周細胞產(chǎn)生的α-MSH通過(guò)腦脊液循環(huán)作用于中樞。此外α-MSH的抗炎活性已經(jīng)在多種動(dòng)物模型中被證實(shí)。這些動(dòng)物模型有刺激過(guò)敏性皮炎、接觸過(guò)敏性皮炎、血管炎、關(guān)節炎、眼部炎癥、胃腸炎、腦部炎癥以及過(guò)敏性炎癥。

在中樞神經(jīng)系統炎癥中，α-MSH參與神經(jīng)免疫調節通路的分子機制如下：α-MSH由其受體介導，降低炎癥反應中最大的調節器分子NF-кB的介導的轉錄活性，進(jìn)而阻止前炎因子的釋放，抑制粘著(zhù)分子的表達，從而降低腦組織損傷，起到營(yíng)養、保護、修復受損腦組織的作用。

α-MSH主要由下丘腦,垂體和多種外周組織細胞產(chǎn)生，由13個(gè)氨基酸組成，大鼠靜脈注射體內半衰期為幾分鐘，對于此類(lèi)蛋白質(zhì)藥物來(lái)說(shuō)，必須考慮腎小球濾過(guò)問(wèn)題，因此，就要通過(guò)對α-MSH進(jìn)行結構的修飾和改造或者其他方法來(lái)延長(cháng)其半衰期。

HSA是人體內源性蛋白，分子量達66kDa，在人體內的半衰期達到19天，具有無(wú)免疫原性、人體相容性好、無(wú)酶活等特性，是許多內源性代謝物質(zhì)和外源性藥物的運輸載體。上述特性使HSA成為長(cháng)效蛋白/多肽類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)理想載體。

因此，本發(fā)明利用白蛋白融合技術(shù)(Albumin Fusion technology)將α-MSH與HSA融合，兩者之間加入具有特殊結構的柔韌性分子接頭(連接肽)，采用本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)方案，不僅保證了融合蛋白的穩定性和生物活性，而且增加了分子量。

雖然現有技術(shù)中公開(kāi)了通過(guò)融合蛋白的表達的策略可以延長(cháng)目的蛋白的半衰期，但是融合蛋白的設計本身是一個(gè)程序復雜、影響因素眾多的過(guò)程，僅通過(guò)序列的簡(jiǎn)單加和是無(wú)法實(shí)現α-MSH的穩定高效表達、延長(cháng)其半衰期的目的的，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。

同時(shí)，為了使上述融合蛋白能夠有效地跨過(guò)血腦屏障，治療腦部炎癥及相關(guān)疾病，本發(fā)明在融合蛋白氨基酸序列中加入了蛋白轉導結構域(Protein transduction domian，PTD)，PTD是近年來(lái)發(fā)現的較理想的跨BBB轉運載體,具有強大的運載功能，能夠轉運高于自身分子量100倍的大分子，可將外源性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、化學(xué)分子、磁珠、脂質(zhì)體轉運通過(guò)細胞膜，且此過(guò)程不受分子大小和種類(lèi)的限制。

基于上述現狀，發(fā)明人公開(kāi)了一種α促黑素細胞激素的融合蛋白，該融合蛋白所具有的獨特的氨基酸序列可以保證其在宿主體內高水平穩定表達，在保留α-MSH原有功能的同時(shí)，體內半衰期顯著(zhù)延長(cháng)，同時(shí)能夠跨過(guò)血腦屏障，治療腦部炎癥及相關(guān)疾病。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種α促黑素細胞激素的融合蛋白，該融合蛋白能在宿主體內高水平穩定表達，半衰期長(cháng)，能夠有效地跨過(guò)血腦屏障，治療腦部炎癥及相關(guān)疾病。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種α促黑素細胞激素的融合蛋白的制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種重組表達載體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種宿主表達系統。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種α促黑素細胞激素的融合蛋白應用。

技術(shù)負責人： 李紅玉  藥學(xué)院